Synevo — европейская сеть медицинских лабораторий в Украине

Информационная служба:
044 20 500 20 (Киев)
0 800 50 70 30 (Украина)

Телефон для справок: 044 20 500 20, 0 800 50 70 30

Методы исследований

Проточная цитофлуориметрия

В основе проточной цитофлуориметрии лежит проведение фотометрических и флуоресцентных измерений отдельных клеток, пересекающих одна за другой вместе с потоком жидкости лазерный луч монохроматического света. Фотометрические каналы используются для оценки размеров клеток и внутриклеточных структур. Частицы, отличающиеся по размерам, по-разному рассеивают свет, при этом характер рассеивания зависит от соотношения длины волны света и диаметра частиц. При одновременной регистрации бокового и прямого светорассеяния возможно выделить все клеточные популяции лейкоцитов. В этом случае удается определить физические свойства любой неокрашенной клетки (размер, гранулярность) и, таким образом, разделить анализируемую клеточную популяцию на отдельные субпопуляции (например, лейкоциты периферической крови на лимфоциты, моноциты и гранулоциты).

Иммуноцитофлюориметрический анализ клеток производится по пяти основным параметрам:

— две характеристики светорассеяния клеток:

  • FSC (forward side scatter) — показатель прямого светорассеяния;
  • ортогональный SSC (90°) (side scatter) — показатель бокового светорассеяния;

— три канала детекции специфического флюоресцентного сигнала красителя на разной длине волны.

Для исследования используют несколько флюоресцентных меток, которые позволяют проводить одновременный двух-, трехцветный и более анализ, так как каждый флюорохром при прохождении через луч лазера испускает свет различной длины волны. Наиболее часто в качестве красящей метки применяется флюоресцеин-изоцианат (FITC), который улавливается FL-1-детектором (зеленый спектр), фикоэритрин (РЕ) — FL-2-детектором (красный спектр), менее часто — тандем цианин-5/фикоэритрин и пиридин-хлорофилл (PerCp, Cy5/PE) — FL-3-детектором и аллофикоцианин (АРС) — FL-4-детектором. При выборе сочетаний флюорохромов для одновременного определения нескольких клеточных маркеров следует учитывать длину волны источника света и способность оптической системы прибора разделять и одновременно регистрировать сигналы от используемых флюорохромов.

Количество лейкоцитов и лейкоцитарная формула определяются после лизиса эритроцитов с помощью проточной цитофлуориметрии, которая позволяет анализировать физические и химические свойства клеток. Проба крови всасывается, разбавляется и окрашивается. Клетки крови затем выстраиваются в линию по одному, проходя через центр проточной камеры, в то время как лазерный луч, излучаемый полупроводником, попадает на них и в результате рассеивается в различных направлениях. Свет, рассеянный фронтально, улавливается фотодиодом и позволяет определить объем клетки. Свет, рассеянный латерально, дает информацию о компонентах клетки (ядре и гранулированных элементах), а латеральный флюоресцирующий свет информирует о величине клеточной ДНК и РНК. Свет, рассеянный латерально и флюоресцирующий латерально, принимается трубкой фотомультипликатора. В конечном результате анализатор отображает два двумерных изображения:

  • на «4DIFF» (X-ось отражает интенсивность латерального света, а Y-ось — интенсивность флюоресцирующего латерального света) появляются 5 лейкоцитарных форм и группа теней эритроцитов;
  • на «WBC/BASO» (X-ось отражает интенсивность латерального света, а Y-ось — интенсивность фронтального света) появляются формы базофилов и остальные формы лейкоцитов, и также эритроцитарные тени.

Показатели анализируемых проб:

  • эритроцитарные: количество эритроцитов, гемоглобин, гематокрит, эритроцитарные индексы (средний объем эритроцитов, среднее содержание гемоглобина в эритроците, средняя концентрация гемоглобина, ширина распределения эритроцитов);
  • лейкоцитарные: общее количество лейкоцитов, лейкоцитарная формула в относительных (%) и абсолютных величинах;
  • тромбоцитарные: количество тромбоцитов, тромбоцитокрит, средний объем тромбоцитов, ширина распределения тромбоцитов.

Анализатор непосредственно подсчитывает количество лейкоцитов и лейкоцитарную формулу, количество эритроцитов, гемоглобина, гематокрит и количество тромбоцитов. Кроме гемограммы и двух изображений, прибор отображает две гистограммы для эритроцитов и тромбоцитов, которые показывают количество клеток и их распределение, в зависимости от объема. Гематологический анализатор также может выявить аномальные или незрелые клетки, отображая это в виде различных предупреждений при анормальной локализации формирований клеток на «WBC/BASO» или «4DIFF».

Автоматический анализатор, работающий на основе проточной цитофлуориметрии с применением флюоресцентного или лазерного полупроводников, используется для подсчета ретикулоцитов и может проводить исследование следующих параметров: процент ретикулоцитов, абсолютное число ретикулоцитов, процент незрелых ретикулоцитов.

Определение СОЭ

  • Ручной метод Вестергрена (Westergren): пробирка помещается в вертикальном положении в держатель с градацией в один миллиметр и определяется уровень седиментации красных кровяных клеток в мм/час.
  • Автоматизированный метод: осуществляется на автоматических анализаторах (СОЭ-мер), контролируемых микропроцессором, измеряющим скорость оседания красных кровяных клеток (СОЭ) с помощью системы инфракрасных лучей. Одновременно могут быть исследованы 40–160 проб в час (в зависимости от количества используемых модулей). Седиментация происходит при комнатной температуре под воздействием гравитации, и результаты выражаются в мм/час согласно методики Westergren.

Определение показателей гемостаза

Осуществляется на полуавтоматических или автоматических анализаторах, принципом работы которых является коагулометрия для гемостаза и протеина S, а также колориметрия для антитромбина III. Для внутреннего контроля качества используются две контрольные плазмы: плазма с нормальными показателями и одна — с патологическими значениями, обеспечивая ежедневный мониторинг точности и достоверности расчетов. Из колориметрических методов исследований используется метод, состоящий в измерении абсорбции монохромного света (с длиной волны 405 нм или 540 нм), который проходит сквозь кювету, где происходит реакция формирования хромофорного вещества. Показатель абсорбции прямо пропорционален уровню антитромбина III в. исследуемой плазме.

Турбидиметрия и нефелометрия

В основе данных методов лежит формирование комплекса антиген-антитело в растворе: растворы антигена и антитела смешиваются, при этом реактив используется в очень малых количествах, а формирование агрегатов происходит быстро. Турбидиметрия измеряет количество непреломленного света, прошедшего через раствор. Фотосенсор расположен на прямой линии с источником света, абсолютно прозрачный раствор пропускает до 100% света, чем выше концентрация частиц, тем меньше проходит света. Нефелометрия измеряет количество рассеянного под прямым углом по отношению к лучу света, фотосенсор расположен под углом 90° к источнику освещения, абсолютно прозрачный раствор не преломляет свет.

Поэтому нефелометрические измерения выявляют рост выше уровня нуля (в особенности турбидиметрия, выявляющая снижение передачи до 100%), нефелометрия наиболее чувствительна к малым концентрациям исследуемых веществ. Поэтапная нефелометрия представляет собой кинетическое измерение формирования агрегатов. Время, за которое изгиб кривой «диспергированный свет — время» является максимальным и пропорционален концентрации антигена. Использование турбидиметрии и нефелометрии: определение альбуминемии и микроальбуминурии, иммуноглобулинов IgА, IgG, IgM и фракций комплемента C3, C4.

Ион-селективные электроды (ИСЭ)

Ион-селективный электрод является трансдуктором (сенсором), преобразующим активность определенного иона, находящегося в растворе, через мембрану в электрический потенциал, который может быть измерен с помощью вольтметра или pH-метром. Мембрана расположена у края пробирки, содержащей внутренний электрод. Изменение потенциала измеряется электродом, расположенным извне, с постоянным потенциалом. Разница потенциалов между двумя электродами зависит от активности иона в растворе, которая связана с концентрацией соответствующего иона, на основании которой и осуществляется анализ.ИСЭ работает по принципу гальванической клетки: потенциал клетки эквивалентен потенциалу ИСЭ минус потенциал референс-электрода.

Определения ИСЭ не подвержены воздействию интерференции так, как цвет пробы. Источники погрешностей — это взаимодействие с другими ионами, по свойствам схожими с исследуемым ионом, разница в степени диффузии ионов — в зависимости от их размеров.

Реакции латекс-агглютинации

Реакции латекс-агглютинации являются серологическими реакциями, основанными на реакции антиген-антитело: микрочастицы латекса, покрытые молекулами антиген/антитело агглютинируют в результате связывания с антителом соответствующего антигена из исследуемой сыворотки. Латекс-агглютинация была адаптирована для количественных исследований, использующих турбидиметрию/нефелометрию, обеспечивая повышение чувствительности.

Автоматизированные методы иммунного анализа

Широкий спектр гормональных, опухолевых, инфекционных, сердечных, костных, аллергологических и аутоиммунных маркеров определяется в лаборатории «СИНЭВО» автоматизированными методами, в основе которых лежит реакция антиген-антитело и методы эти называются иммунохимическими (аналог термина «immunoassay» в специализированной английской литературе). Специфическое распознавание между антигеном и антителом, характерное для иммунологических тестов, получило широкое распространение в качестве аналитического метода.

Иммунохимические тесты используются для определения и антигенов, и антител. Чувствительность иммунологических методов повысилась за счет развития новых систем приема сигналов и технологий с твердой фазой, что позволило проводить определение уровня менее 0,1 пг/мл антигена, присутствующего в крови. Они могут применяться как для малых молекул (гаптены), так и для макромолекулярных белковых комплексов, а также для определения антител к аллергенам, инфекционным возбудителям, антигенов.

Основная характеристика иммунохимических тестов состоит в маркировке антигена или антитела веществом, генерирующим сигнал, который можно измерить, осуществляя детекцию комплекса антиген-антитело. В зависимости от типа этих веществ, иммунохимические тесты классифицируются следующим образом:

  • радиоиммунологические тесты: используется маркировка радиоизотопами (125I, 131I, 3H, 14 °C, 32P);
  • иммуноферментные тесты: используется маркировка ферментами;
  • иммунохимический тест с детекцией с помощью флюоресценции: используется маркировка при помощи флуоресцентных молекул (флюорохромов);
  • иммунохимические тесты с детекцией за счет хемилюминесценции: используется для маркировки молекул, которые генерируют хемилюминесценцию, такие как производные люминола, акридиновые эфиры, производные нитрофенил оксалата;
  • иммунохимические тесты с детекцией за счет электрохемилюминесценции (ЭХЛМ, ECLIA): используется для маркировки определенных органических соединений (соединения рутения, осмия и т. д.), генерирующих электрохимическое свечение.

Иммуноферментные методы

Этот метод использует маркировку ферментами, которые представляют альтернативу радиоизотопному методу. Иммуноферментный анализ базируется на двух принципах. Первый принцип заключается в установлении способности энзимов и антител, ковалентно или нековалентно связанных с твердой основой, сохранять свою функциональную активность (расщепление ферментов и связывание антигенов и антител). Второй принцип заключается в создании комплекса антитело-фермент (АТ-Ф) в виде конъюгата, сохраняющего свою биологическую активность в растворе.

Существуют модификации ИФА: гомогенные и гетерогенные методы. Гомогенные — все три стадии ИФА проходят в растворе, и между ними нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов. Гетерогенные — проходят в двухфазной системе с участием твердой фазы — носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывки), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы — в растворе). Для обнаружения антигенов используют следующие методы ИФА: конкурентный метод, «сэндвич»-метод, двойной «сэндвич»-метод. Для обнаружения специфических антител используют следующие методы ИФА: конкурентный метод, метод с использованием меченого антигена, двойной «сэндвич»-метод для антител, непрямой метод; гомогенный метод.

Конкурентный метод. В данном методе используется реакция между антигенами, связанными с твердой фазой и конкурирующими между собой меченными ферментом антителами (конъюгатом) и антителами опытной пробы. Конъюгата связывается тем меньше, чем больше специфических антител в пробе. После удаления несвязавшихся компонентов в ходе промывки измеряют ферментативную активность иммобилизованного комплекса.

Метод с использованием меченого антигена. На твердой фазе иммобилизованы антитела, специфические к определенному классу Ig (либо — к нескольким классам). Исследуемую сыворотку вносят на твердую фазу. Образуется комплекс АТ-АТ. После удаления в ходе промывки несвязавшихся компонентов вносят избыток конъюгата, которым является меченый антиген. Метод позволяет определить все классы иммуноглобулинов, в том числе и IgЕ.

Метод двойного «сэндвича» для антител. На твердой фазе иммобилизованы антитела, специфические к определенному классу Ig. В результате добавления антигена происходит его связывание со специфическими антителами сыворотки. Затем к твердой фазе добавляют избыток антител к тому же антигену, меченых ферментом (конъюгат). Антитела в составе такого конъюгата должны быть поликлональными.

Непрямой метод. На твердой фазе иммобилизируют антиген, затем добавляют исследуемую сыворотку. В присутствии сывороточных специфических антител образуется комплекс (АГ-АТ). После удаления несвязавшихся белков к твердой фазе добавляют избыток меченых антител, специфических к определенным антителам (антивидовые). После удаления в ходе промывки несвязавшегося конъюгата к твердой фазе добавляют раствор субстрата. При этом ферментативная активность будет пропорциональна количеству специфических антител в исследуемом образце. Данный метод наиболее распространен и используется в большинстве коммерческих тест-систем.

Гомогенный метод определения антител. На твердой фазе иммобилизован антиген. В лунку вносят конъюгат этого же антигена с ферментом и исследуемую сыворотку. Специфические антитела образуют сложный комплекс: одновременно связываются с антигенами, находящимися на твердой и в жидкой фазах. При связывании антителами конъюгата изменяется активность фермента в исследуемом образце.

Наиболее часто используемыми тестами являются:

  • ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ);
  • EIA (иммуноферментный анализ);
  • EMIT (радиоиммунологический анализ с ферментативным усилением).

ELISA является чувствительным методом, поскольку каждая молекула фермента может преобразовывать многие молекулы субстрата, выступающие в качестве усилителя реакции. Энзимы вырабатывают продукты окрашивания, которые осаждаются, так как они не диффундируют из места образования. Антиген связан с твердой поверхностью, первичное антитело связывается с антигеном, а вторичное энзим-меченное антитело связывается с первичным антителом. Энзим превращает субстрат в окрашенный конечный продукт, который образует преципитат пропорционально количеству антител из сыворотки пациента.

Метод ELISA тип «сэндвич» с присоединенным антигеном увеличивает специфичность методики, требуя связывания антитела с двумя различными эпитопами (могут происходить перекрестные реакции в одном из эпитопов, но существует возможность произойти в двух эпитопах одновременно). Моноклональное антитело связывается на твердой поверхности и связывает антиген, если оно присутствует в сыворотке пациента. Несвязанный материал промывается, одно их двух маркированных антител, которое распознает чужой эпитоп, связывается с антигеном, новое промывание разделяет несвязанные антитела, затем присоединяет к субстрату, который превращает в окрашенный продукт пропорционально количеству антигена, присутствующего в исследуемой сыворотке.

Метод ELISA конкурентного типа состоит в следующих этапах: внутренняя поверхность микропластинки покрыта антителами с точно оттитрованной концентрацией. Антиген из пробы и энзим-меченый антиген из конъюгата «конкурирует» в одной реакции для ограниченного количества мест из иммобилизированного антитела, после разделения конъюгата присоединяется хромогенный субстрат. Окрашенный продукт в результате реакции обратно пропорционален количеству антигена из пробы.

Тесты EIA нуждаются во вторичном процессе для получения сигнала в результате каталитического действия фермента. В качестве твердой фазы для отделения свободного конъюгата от связанного могут использоваться пластинки с ковшиками, пластиковые шарики, пластиковые трубки, магнитные частицы или латекс с фильтрами. Использование магнитных частиц или латекса обеспечивает сокращение времени реакции. Наиболее часто используемыми ферментами являются пероксидаза из хрена, щелочная фосфатаза, бетагалактозидаза, глюкозооксидаза, уреаза и каталаза. Выбор используемого фермента определяется субстратом для распознавания. EIA колориметрический: используются хромогенные субстраты, такие как 3-этил-бензотиазолин-6-сульфонат, который образует с перекисью водорода под действием пероксидазы зеленый цвет, или n-нитрофенилфосфат, образующий желтый цвет под действием щелочной фосфатазы.

Метод хемилюминесценции. Одним из современных методов лабораторной диагностики иммунологического профиля является хемилюминесцентный иммуноанализ (CLIA). Процесс хемилюминесценции включает в себя две стадии: образование продукта в электронном возбужденном состоянии (хемилюминесцентная реакция) и испускание кванта света (люминесценция). Хемилюминесценция — это процесс излучения фотонов (свечение) при переходе электронно-возбужденных продуктов окислительных химических реакций в исходное энергетическое состояние. В таких реакциях выделяется значительное количество энергии и квантовый выход излучаемого света достаточно высок.

EIA с хемилюминесценцией (CLIA) используют хемилюминесцентные субстраты, которые взаимодействуют с различными ферментами, используемыми для маркировки, ферментная хемилюминесцентная реакция генерирует свет. Настоящие системы используют производные люминола с пероксидазой и перекисью водорода (или другая ферментативная система, которая генерирует перекись водорода как, например, глюкозоксидаза или уриказа) плюс потенциатор (производные фенола как, например, n-йодофенол), который увеличивает эмиссию света до 3000 раз. Окислительные реакции люминола могут быть представлены огромным количеством интерференций, которые увеличивают неспецифический сигнал. Другая система использует щелочную фосфатазу и производное адамантилдиоксиэтана (AMPPD), которое не требует других молекул для эмиссии света, в отличие от люминола, которому необходимы окислительные соединения. AMPPD является сложным субстратом, образованным из одной группы адамантила, играющим роль стабилизатора целой молекулы, связь диоксетана — как источника энергии, фосфорилэстер — как место для энзимного расщепления и фенил группа — для хемилюминесценции. Этот новый субстрат сделал возможным развитие исследований сверхвысокой чувствительности выше, чем в исследованиях RIA по чувствительности приблизительно 0,1 пг/мл, времени и простоте выполнения. EIA, как и RIA, может быть разделена на конкурентные исследования (с избытком исследуемого вещества, используя антиген-ферментный конъюгат) и неконкурентные (с реагентом в избытке), которые включают иммунометрические тесты «сэндвич» для определения антигена (гормоны, онкомаркеры, инфекционные агенты, белки плазмы) и непрямые тесты для определения антител (анти-HVC, аутоантитела).

Преимущества иммуноферментных тестов заключаются в разработке чувствительных исследований с помощью эффекта амплификации ферментов. Реактивы являются стабильными, отсутствует радиологический риск, как и недостатки. Измерение ферментной активности может быть более сложным, чем измерение активности некоторых радиоизотопов, но ферментативная активность может быть обусловлена составляющими ингредиентами сыворотки.

Иммунохимические тесты с определением при помощи электрохемилюминесценции основываются на использовании комплекса рутения (II)-три (бипиридил) [Ru(bpy)3]2+ с трипропиламином (TPA), который генерирует электрохимический свет, в связи с циклом окислительно-восстановительных реакций: Ru(bpy)32+ имеет реактивный участок для связывания с исследуемым веществом, используется агент активатор, такой как N-гидроксисукцинимид (NHS), так как он легче связывается с аминогруппами белков, гаптенов или нуклеиновых кислот, что дает возможность применять данный метод к различным исследуемым веществам. Эмиссия света провоцируется электрическим импульсом иммунного комплекса (который содержит соединение рутения), фиксированного на микрочастицах, обернутых в стрептавидин. Преимущество электрической инициации хемилюминесцентной реакции состоит в том, что она на всем протяжении может точно контролироваться. Существуют три основных принципа данного метода:

  • принцип «сэндвича»: сначала проба пациента перемешивается с антителами, связанными с биотином и антителами, связанными с рутением, после инкубирования смеси добавляются парамагнетические микрочастицы, обернутые стрептавидином (твердая фаза). После второго инкубирования реакционная смесь аспирируется в измерительную камеру, а свободный конъюгат удаляется. В дальнейшем используется электрический ток для возбуждения рутения и генерации сигнала, позволяющего выявить комплекс антиген-антитело, количество вырабатываемого света прямо пропорционально количеству антигена в пробе;
  • конкурентный принцип: изначально перемешивается исследуемое вещество и антиген, связанный с биотином. После первичной инкубации добавляются антитела, связанные с соединением рутения, и парамагнитные микрочастицы, обернутые с стрептавидином. Конъюгированные антитела связываются с еще не занятыми участками антигенов, связанных с биотином, а весь комплекс связывается с микрочастицами за счет взаимодействия биотина со стрептавидином. После второй инкубации реактивная смесь проходит в измерительную камеру, иммунные комплексы иммобилизированы магнитным методом на поверхности электрода, а несвязанные компоненты удаляются путем вымывания. Хемилюминесцентная реакция стимулируется электрически, а количество вырабатываемого света обратно пропорционально количеству антигена;
  • принцип «bridging»: схож с принципом «сэндвича», но направлен на определение антител и включает антиген, связанный с биотином, и антиген, помеченный рутением.

Метод проточной иммунофлуоресценции основан на мультиплексном анализе и возможности одновременного исследования до 25 аналитов из одного набора реагентов. В основе лежит использование магнитных микросфер размером 8 мкм. Микросферы покрыты лигандом (например, антиген, антитело, аналит и т. д.), специфичным для определенного теста. Микросферы с разными лигандами затем смешиваются в одном наборе реагентов, позволяя одновременно определять множество аналитов из одной пробы пациента. После проведенной иммунофлюоресцентной реакции микросферы по очереди, одна за другой, проходят через кювету, где определяется степень флюоресценции. Каждая частица вначале проходит через красный лазер, где происходит распознавание, и затем через зеленый, где подсчитывается количество таких частиц. Степень флюоресценции измеряется отдельно для каждой частицы, проходящей через репортерный лазер. Проводится 100000 измерений в 1 мин. Программное обеспечение переводит репортерный сигнал в единицы относительной флюоресцентной интенсивности (RFI). Система проводит измерение, как минимум, 150 частиц для каждого аналита. Мультиплексные исследования характеризуются очень высокой воспроизводимостью.

Mетод IFT (иммунофлуоресцирующих антител). В основе метода лежит иммуноферментный метод, проводимый на Биочипах с помощью флюоресцирующей метки. В качестве Биочипа используют культуру клеток НЕр-2 и срезы тканей печени, почек, кишечника и мозжечка крысы и приматов. С помощью микроскопа идентифицируют характерное свечение (зеленое) в препарате, его локализация указывает на вид заболевания. Метод позволяет провести скрининг многих аутоиммунных заболеваний и с большей точностью провести дополнительное специализированное исследование с маркерами, присущими тому или иному заболеванию.

Метод иммунохроматографии. Иммунохроматографический анализ (ИХА) — метод, основанный на разделении частиц методом парной связки и реакции между антигеном и соответствующим ему антителом в биологических материалах (моча, слюна, цельная кровь, сыворотка или плазма крови и т. п.). Данный вид анализа проводится с помощью специальных экспресс-тестов, тест-полосок или тест-кассет. Одним из самых важных свойств антител является их способность избирательно связываться с антигеном. Это означает, что каждое антитело связывается только с определенным антигеном. На этой уникальной особенности антител и основаны все иммунологические методы анализа, в том числе и ИХА. Принцип действия иммунохроматографического теста заключается в следующем: при погружении теста в физиологическую жидкость она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Вместе с жидкостью движется жидкая фаза тест полоски содержащая антитела с красителем. Если в этой жидкости присутствует исследуемый антиген (гормон, онкологический или инфекционный маркер), то происходит его связывание, как с первым типом антител, так и со вторым. При этом происходит накопление антител с красителем вокруг антител. Визуально накопление антител с красителем проявляется в виде окрашивания тест полоски. Свободные антитела с красителем мигрируют далее вдоль полоски и неизбежно взаимодействуют с вторичными антителами в контрольной зоне, где и наблюдается вторая окрашенная (контрольная) полоса.

Реакции агглютинации

В реакциях агглютинации клетки или частицы связаны друг с другом за счет взаимодействия антиген-антитело. Антиген или антитело, прикрепленные к частицам, будь это эритроциты, латекс или металлические частицы, взаимодействуют с исследуемым веществом из пробы; как результат иммунной реакции, частицы представляют существенную агглютинацию, которая видна невооруженным глазом. Гаптен с единственным участком для связывания не может присоединиться, так как фиксируется твердой фазой. Реакции агглютинации являются очень чувствительными: маленькое количество антител может агглютинировать с большим количеством частиц. Также они являются очень быстрыми, протекая за несколько минут. Благодаря чувствительности (5 нг/мл) и быстроте широко используются в практике. Прямая/пассивная агглютинация используется для детекции специфических антител с антигенами; обратная агглютинация используется для детекции растворенных антигенов в пробе с соответствующими антителами. Реакции агглютинингибирования основываются на конкурентном принципе, в котором агглютинация частиц, связанных с гаптенами ограниченным количеством антител, подавляется свободным гаптеном, содержащимся в образце исследуемого вещества. Гемагглютинация представляет собой агглютинацию эритроцитов, вызванную антителами. Будучи пентамерной молекулой, иммуноглобулин IgM является лучшим гемагглютиногеном, чем IgG.

Пассивная гемагглютинация: используются эритроциты, в которых антиген был присоединен химическим способом; агглютинация выявляет антитела к соответствующим антигенам. Например, группа АВ0 или ТРНА (тест гемагглютинации на Treponema pallidum). Обратная пассивная гемагглютинация: используются эритроциты, к которым были присоединены антитела; они агглютинируются антигенами. Агглютинация частиц желатина и других синтетических частиц: используются специальные неантигенные частицы, которые устраняют проблемы, связанные с наличием гетерофильных антител в ходе использования эритроцитов как частиц; могут заменить любой тест, основанный на гемагглютинации, за исключением тестов, использующих эритроциты из исследуемой пробы как частицы. Обеспечивают более чувствительную детекцию, чем при использовании клеток крови. Концентрация антител может определяться путем титрования: осуществляется серийное разведение сыворотки; в каждом разведении концентрация антител уменьшается в два раза. В определенном разведении не существует достаточной концентрации антител, которые связывались бы со всем антигеном полностью; титр антител представляет фактор разведения в последней пробирке, где произошла полная реакция. Реакция может быть ингибирована при повышенной концентрации антител. Ингибиторы обычно представлены в малых концентрациях. По мере растворения ингибитора, реакция становится положительной. Результат изначально отрицательный, называется «прозона».

Реакции преципитации

В реакциях преципитации комплекс антиген-антитело образует видимый преципитат, который можно определить качественно невооруженным взглядом или количественно при помощи детектора. Формирование преципитата нуждается в формировании крупных молекулярных агрегатов путем связывания антигена с антителом. Малые комплексы остаются растворенными. Для формирования больших комплексов и антитела, и антигены должны быть поливалентными. Концентрация преципитата зависит как от абсолютной концентрации антигена и антитела, так и от их относительной концентрации. Если антитело или антиген находятся в избытке относительно друг друга, образуется малое количество растворимых комплексов, преципитат уменьшается количественно или отсутствует, и, соответственно, антитела или антигены остаются свободными в растворе. При приблизительно равных количествах антител и антигенов начинается формирование преципитата. Соотношение концентраций, при которых образуется максимальное количество преципитата, и ни антитела, ни антигены не остаются в растворе, и являются точкой эквивалента. Другие условия, такие как температура, рН, ионное насыщение раствора, сродство и авидность антител также являются важными в формировании иммунного преципитата.

Иммуноэлектрофорез

Первоначально осуществляется электрофоретическое разделение сывороточных белков в гель-агаре, далее антитела размещаются в бороздке в агаре. Антитела и белки диффундируют друг к другу и формируют дуги преципитации; различные белки могут идентифицироваться специфическими антителами. Если специфические антитела распределены по всей поверхности геля, то формируется полоска преципитации.

Бактериологические исследования

Нормальная микрофлора человека — это совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенными взаимосвязями и местом обитания. Виды нормальной микрофлоры:

  • резидентная — постоянная, характерная микрофлора для определенного биотопа/локуса организма человека;
  • транзиторная — временно попавшая, нехарактерная для данного биотопа; она активно не размножается при нормальном состоянии микробиоценоза.

Нормальная микрофлора выстилает слизистые оболочки в виде биопленки: этот полисахаридный каркас состоит из полисахаридов микробных клеток и муцина. Стерильными в организме человека являются: кровь, ликвор, суставная жидкость, плевральная жидкость, лимфа грудного протока, внутренние органы (сердце, мозг, паренхима печени, почек, селезенки, матка, мочевой пузырь).

Дисбактериоз/дисбиоз — это любые количественные или качественные изменения типичной для данного биотопа нормальной микрофлоры человека, возникающие в результате воздействия на макро- или микроорганизм различных неблагоприятных факторов.

Микробиологическими показателями дисбактериоза служат:

  • снижение численности одного или нескольких постоянных видов бактерий;
  • потеря бактериями тех или иных признаков или приобретение новых;
  • повышение численности транзиторных видов бактерий;
  • появление новых, несвойственных данному биотопу видов бактерий;
  • ослабление антагонистической активности нормальной микрофлоры.

Среди бактерий по способности вызывать заболевание выделяют:

  1. Патогенные — виды бактерий, потенциально способные вызывать инфекционное заболевание. Патогенность — это способность микроорганизмов, попадая в организм, вызывать в его тканях и органах патологические изменения. Это качественный видовой признак, детерминированный генами патогенности — вирулонами. Они могут локализоваться в хромосомах, плазмидах, транспозонах.
  2. Условно-патогенные бактерии. Основная часть УПМ относится к нормальным обитателям многих биотопов организма человека и находятся с ним в симбиотических отношениях, но при определенных условиях (снижении защитных сил организма) они могут вступать с хозяином в конкурентные отношения и вызывать у него болезни. УПМ обладают почти тем же набором факторов патогенности, что и большинство патогенных микробов — продуцируют гиалуронидазу, эластазу, коагулазу, фибринолизин, нейраминидазу, лецитиназу, нуклеазы, дезаминазы, декарбоксилазы и другие ферменты агрессии, оказывающие деполимеризующее или конформационное действие на свободные или входящие в состав клеток и волокон молекулы. Повреждающее действие ферментов агрессии обусловлено не только разрушением структур клеток, тканей и органов, но и токсическим действием продуктов ферментативного распада (мочевина, сероводород, амины и др.).
  3. Сапрофитные бактерии не вызывают заболевания, так как они не способны размножаться в тканях макроорганизма.

Реализация патогенности идет через вирулентность — способность микроорганизма проникать в макроорганизм, размножаться в нем и подавлять его защитные свойства. Это штаммовый признак, он поддается количественной характеристике.

Бактериологические методы исследования — это совокупность методов изучения свойств микроорганизмов, определения их систематического положения. Для этого необходимо, прежде всего, изолировать отдельные виды микробов и вырастить их в виде так называемых «чистых культур», а затем идентифицировать, т. е. определить род и вид выделенного штамма в соответствии со специальными определителями. Качество результатов бактериологического исследования, в первую очередь, зависит от качества процедуры сбора и регламентированных условий транспортирования биоматериалов в бактериологическую лабораторию. Правильная техника сбора и транспортирования биоматериалов в бактериологические лаборатории позволяет значительно снизить уровень преаналитической ошибки и повысить качество работы лаборатории по объективизации результатов.

Быстрое выявление микроорганизмов и изучение морфологии, необходимой для микробиологической диагностики, осуществляется путем микроскопического исследования. Микроскопическое исследование может быть свежим, между предметным и покровным стеклами, или зафиксированным и окрашенным. Под мазком понимается микробный материал (патологический материал или микробная культура), размещенный в тонком слое на поверхности предметного микроскопического стекла. Для создания мазка используются микроскопические чистые и обезжиренные стекла, которые маркируются именем пациента с одного края и названием микробиологического материала, который необходимо выявить, с другого. Для каждого патологического материала делается 2 мазка (исключением являются пункционные жидкости, из которых делают 4 мазка). Один окрашивается по Граму (для выявления бактерий), а второй — Giemsa (для определения клеточной специфичности). Мазок из патологического материала носит название окрашенного микроскопического исследования и имеет очень важное значение для медицинской бактериологии. Он применяется для следующих целей:

  • быстрая ориентировка в диагнозе при неотложных состояниях (пример: бактериальный менингит);
  • ориентация микробиолога при уничтожении несоответствующего патологического материала (пример: слюна вместо мокроты);
  • корреляция между состоянием пациентов и результатами, которая позволяет перейти от предварительного к окончательному диагнозу.

Почти все бактерии с клиническим значением могут быть выявлены при помощи окрашенной микроскопии. Исключение составляют бактерии, которые обитают, в большинстве случаев, внутриклеточно, например, Chlamidia, а также те, которые располагаются в клеточной стенке (например, Mycoplasma и Ureaplasma) и те, которые имеют достаточные размеры для визуализации в микроскопе (пример: спирохета).

Для видовой идентификации бактерий необходимо исследовать следующие их свойства:

  • Морфологические (форму и структуру бактериальной клетки).
  • Тинкториальные (способность окрашиваться различными красителями).
  • Культуральные (характер роста на питательной среде).
  • Биохимические (способность утилизировать различные субстраты).
  • Антигенные (так род сальмонелл за антигенными свойствами составляет более 2500 сероваров).

Методы окрашивания

  • Простые окрашивания: используется один краситель и выявляется только морфология микроба — размеры, форма, группировка клеток, наличие капсулы. Из методов простого окрашивания традиционным и быстрым является окрашивание метиленовым синим, который окрашивает в синий цвет все клеточные элементы — бактерии, лейкоциты, клетки эпителия.
  • Дифференцированное окрашивание: выявляет, кроме морфологических характеристик, и цветовые реакции микроорганизмов. Окрашивания по Граму и Цилю-Нильсену являются наиболее используемыми в бактериологии. Различные типы окраски бактерий при использовании методики окрашивания по Граму зависят от структурных особенностей клеточной стенки. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в красный. Лейкоциты и эпителиальные клетки содержат цитоплазму, окрашенную в розовый цвет, и ядро — в красный цвет. Окрашивание по Цилю-Нильсену используется для идентификации следующих групп бактерий: Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella и ооцист Cryptosporidium, Isospora, Sarcocystis и Cyclospora. Обычно в бактериологии окрашивание по Цилю-Нильсену применяется для выделения микобактерий. Они, в отличие от других бактерий, благодаря наличию в бактериальной стенке некоторых восковых веществ, окрашиваются при комнатной температуре основным фуксином и выдерживаются для обесцвечивания в растворимых неорганических кислотах и спирте. Кислото- и спиртоустойчивые бациллы окрашиваются в красный цвет, а некислотоустойчивые — в синий цвет, так же, как и лейкоциты и клетки тканей, цитоплазма которых окрашивается в голубой с голубым ядром.

Внутренний контроль качества мазков является обязательным и проводится с положительным и отрицательным контрольным образцом. При окрашивании по Граму используем следующие контрольные образцы:

  • положительный образец: Staphylococcus aureus АТСС 25923;
  • отрицательный образец: Escherichia coli АТСС 25923.

Культивирование

Бактерии, принадлежащие к различным видам, могут иметь схожие микроскопические характеристики, поэтому их идентификация предполагает и изучение физиологических характеристик, исследуемых «in vitro» на питательных средах. Бактериальная культура представляет собой результат роста и размножения бактерий в питательной среде и имеет цель:

  • выделение патогенных микроорганизмов из отобранного патологического материала;
  • идентификация патогенных агентов;
  • определение чувствительности к антибиотикам в целях инициации и мониторинга антимикробной терапии.

Классификация сред для культивирования может проводиться в зависимости от:

Толерантности:

  • обычные среды, позволяющие культивировать большое количество видов бактерий;
  • специальные среды, позволяющие культивировать ограниченное число видов, иногда — только предназначенные для единственного вида.

Цели исследования:

  • обогащенные среды (всегда жидкие) для исследования определенных групп бактерий;
  • среды для выделения: обычные, недифференциальные, дифференциальные, которые отличаются одной характерной чертой таксономической группы или рода;
  • селективные среды, ингибирующие определенные группы бактерий, способствуя процессу размножения других групп.

Идентификация:

  • тест-среды — конвенциональные или микротест-среды;
  • мультитест-среды — ассоциированные или комбинированные.

Для каждой категории отобранного патологического материала используется традиционная среда или набор сред, позволяющих выделить бактерии, наиболее часто вовлеченные в соответствующие инфекционные процессы. Этот набор традиционных сред может быть дополнен другими средами, в соответствии с клинико-эпидемиологическими данными. Для выделения патогенных колоний из мультиконтаминированного продукта необходимо провести посев на дифференциальные среды. В случае, когда установлено, что отобранная проба содержит уменьшенное количество колоний, необходимо использовать жидкие обогащенные среды (бульон для аэробных колоний, тиогликолятный бульон с резазурином для анаэробов, селенитовый бульон для копрокультуры и т. д.). Инкубация сред для посева проводится с учетом высоких требований, предъявляемых к подозрительным бактериям:

  • аэробные бактерии культивируются в обычных условиях воздушной среды;
  • карбоксифильные бактерии требуют инкубации при повышенном содержании СО2 в воздушной среде в эксикаторе с использованием свечки;
  • строго анаэробные бактерии культивируются при помощи систем GasPak.

Большинство бактерий растут при 37 °С, в отличие от грибов, оптимальная температура роста которых — 30 °С. Длительность инкубирования сред составляет 24–48 часов для обычных бактерий; 2–5 суток — для грибов.

Наблюдение культивирования: аспект культивирования зависит от типа и состава среды. В жидкой среде рост может быть равномерным, с образованием отложений, гранул, пленки, колец, газа, пигмента. На твердых средах бактерии образуют колонии, характер которых (форма, размер, поверхность, прозрачность, консистенция, запах) и количество ориентирует микробиолога на правильный ход диагностики. Важным аспектом является отсутствие бактериального роста в случае обычных мультиконтаминированных продуктов (например, назофарингеальный экссудат, копрокультура, вагинальные выделения). Данный факт предполагает, что пациент проходит системное или местное лечение антибактериальными препаратами. Клиническое значение некоторых выделенных культур может быть установлено также на основе первичной культуры, в случае отбора выделенных культур из неконтаминированных проб (жидкость из пункции) или грамотрицательных бацилл, выделенных за определенным порогом в количественной урокультуре. При выделении монобактериальных культур из нормальных стерильно отобранных проб (гемокультура, жидкость из пункции) проводится прямая идентификация и антибиотикограмма. Из мультиконтаминированных культур проводится пересев колоний, затем — идентификация до уровня вида и тест на чувствительность к антибиотикам. Их селекция осуществляется, в зависимости от аспекта колонии, характера отобранного образца, клинической диагностики и результатов микроскопического исследования с окрашиванием. Реакции антиген-антитело (агглютинация на стекле и латекс-агглютинация) находят применение в лаборатории при идентификации антигенов из некоторых выделенных культур с клиническим значением при подтверждении рода и вида. Колонии E.coli, вызывающие диарейный синдром, классифицируются на основе патогенных механизмов у энтеропатогенной E.coli (EPEC), энтероинвазивной E.coli (EIEC), энтеротоксигенной E.coli (ETEC), энтерогеморрагической E.coli (EHEC), энтероагрегативной E.coli (EAEC). Биохимическая идентификация не дифференцирует патогенные штаммы Е. coli от непатогенных, поэтому рекомендуется провести тест по серотипированию. Врач-клиницист на основе клинических признаков должен уточнить в направлении серотип, на который должна быть исследована проба пациента. Высев на обогащенные среды (например, бульон с селенитом натрия) и на селективные среды способствует росту сальмонелл и позволяет дифференцировать от других видов энтеробактерий.

Бета-гемолитические стрептококки, изучаемые в медицине:

  • Str.pyogenes (группа A), вызывающие фарингиты, кожные инфекции, половые инфекции, последствия постстрептококковой инфекции;
  • Streptococcus (группа B), являющиеся частью нормальной микрофлоры урогенитального тракта женщины, верхних дыхательных путей, нижнего пищеварительного тракта; у новорожденных детей, инфицированных матерью, вызывают менингит, септицемию, у взрослых — инфекции с различной локализацией, а у беременных — аборты и послеродовую септицемию;
  • группы C и G вызывают схожие инфекции со стрептококком A, но немного реже.

Антибиотикограмма

Микробиологическая лаборатория играет важную роль в лечении инфекций, используя идентификацию бактерий и тестирование на чувствительность к антибиотикам. Антибиотикограмма необходима в следующих случаях:

  • выбор антибиотика для лечения с учетом чувствительности к нему микроорганизмов;
  • выявление тех штаммов, которые обладают энзимами, способными инактивировать действие антибиотиков in vivo;
  • эпидемиологический надзор за резистентными бактериями;
  • сравнение резистентных фенотипов штаммов, вызывающих нозокомиальные инфекции.

Проведение антибиотикограммы являются стандартными: состав среды, рН среды, плотность посевного материала, длительность и температура инкубации, стабильность и концентрация микробиального вещества. Лаборатория имеет автоматический «расшифровщик» антибиотикограммы (по диффузиметрическому методу), который имеет встроенную в софт программу — «Эксперт», которая соответствует этому стандарту, со способностью выявлять штаммы, продуцирующие пенициллиназу и бета-лактамазу широкого спектра, и также другие резистентные фенотипы. Кроме классического метода, используемого во всех лабораториях, проводится и автоматизированная антибиотикограмма. Автоматический анализатор, находящийся в работе, может идентифицировать микроорганизмы и тестировать их на чувствительность к антибиотикам в течение нескольких часов (от 2 до 12 часов). Длительность изменяется, в зависимости от семейства, к которому относятся изучаемые колонии. Типы идентифицируемых микроорганизмов многочисленны и включают в себя как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии. Выделение патогенного микроорганизма в чистой культуре (необходимое условие для получения правильного результата) позволяет идентифицировать и одновременно тестировать на чувствительность к антибиотикам на этом автоматическом анализаторе. Таким образом, имеется возможность обнаружения ферментов, которые ингибируют действие антибиотиков in vivo и автоматическая интерпретация результата антибиотикограммы, в зависимости от наличия или отсутствия этих ферментов.

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗАТОР «VITEK 2 Compact». Анализатор «VITEK 2 Compact» предназначен для работы с «чистой» культурой бактерий и выполняет автоматическую идентификацию культур и определение чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам.

Этапы исследования:

1. Технология посевов биоматериалов и обработки роста бактерий аналогична классическому методу. Для ускорения роста медленнорастущих бактерий и определения их рода используются хромогенные среды (24–48 часов).

2. Из отдельно-растущих колоний бактерий готовятся препараты для микроскопии — выявление морфологии бактерийных клеток и вида окраски клеток бактерий по Граму (грамотрицательные и грамположительные культуры).

3. Приготовление суспензии бактерий из одной или нескольких морфологически идентичных колоний для:

3.1. Идентификация культур проводится на картах, содержащих определенный набор биохимических тестов, позволяющих идентифицировать большинство:

  • ферментирующих и не ферментирующих грамотрицательных палочек;
  • клинически важных грамположительных микроорганизмов;
  • клинически значимых прихотливых микроорганизмов (Neisseri/Haemophilus);
  • клинически значимых анаэробных микроорганизмов и видов рода Corynebacterium;
  • идентификация аэробных спорообразующих палочек семейства Bacillaceae;
  • клинически значимых дрожжей и дрожжеподобных организмов.

3.2. Определение чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам для большинства клинически значимых грамотрицательных палочек, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae и дрожжевых грибов.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция — это технология, направленная на получение in vitro копий специфической нуклеотидной последовательности генома определенного конкретного микроорганизма, вируса. В основе ПЦР лежит многократное копирование определенного фрагмента дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) с помощью фермента термоустойчивой ДНК-полимеразы и специфических праймеров. ПЦР позволяет определять специфический участок генома биологического агента.

Преимущества метода ПЦР перед другими методами клинической лабораторной диагностики:

  1. Универсальность. Метод ПЦР дает возможность работать практически с любым видом биологического материала: цельная кровь, плазма, урогенитальные соскобы, слюна, моча, буккальный, заднеглоточный соскоб, спинномозговая, синовиальная жидкость.
  2. Высокая специфичность. Высокая специфичность метода основана на выявлении уникальных для микро- (макро-) организма участков генетического материала. Высокая специфичность ПЦР (100%) определяется способностью праймеров точно распознавать определенный участок нуклеиновой кислоты и связываться с ним по принципу комплиментарности. Таким образом, ПЦР-диагностикумы дают возможность избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами.
  3. Высокая чувствительность. Высокая чувствительность, основана на экспоненциальном принципе накопления продукта. Аналитическая чувствительность дает возможность проведения не только качественной (наличие), но и количественной (концентрация) оценки содержания нуклеиновой кислоты. В настоящее время реальный порог чувствительности амплификационных тест-систем позволяет определять несколько сот копий в исследуемом образце.
  4. Относится к методам прямого выявления возбудителя.

Этапы ПЦР-анализа:

  • обработка клинического материала;
  • амплификация;
  • детекция продуктов амплификации.

Обработка клинического материала;

  • пробоподготовка биологического материала;
  • выделение ДНК/РНК с добавлением ВКО (внутренний контрольный образец).

Внутренний контроль ПЦР-анализа — это: препарат ДНК/РНК, добавленный к каждому исследуемому образцу на этапе обработки биологического материала, который проходит через все стадии ПЦР-анализа — экстракции нуклеиновых кислот (НК), ОТ, амплификации. На этапе детекции результатов амплификации ВК позволяет судить о качестве проведения ПЦР-анализа в целом, а не отдельных его этапов. Классификация ВКО: РНК-контроли и ДНК-контроли, защищенные и незащищенные, эндогенные и экзогенные. Например, при выявлении ВПЧ в исследуемом материале методом ПЦР используется эндогенный ВКО — b-глобиновый ген эпителиальных клеток цервикального канала. Отсутствие данного ВКО в ПЦР-анализе позволяет судить о качестве забора материала.

Выделение ДНК/РНК является ответственным этапом подготовки материала для проведения амплификации, т. к. в результате мы получаем очищенный препарат ДНК/РНК. Выделение НК — это максимальное освобождение ДНК/РНК путем лизиса клеточных оболочек и деструкция нуклеопротеидных комплексов, инактивация нуклеаз, и удаление ингибиторов ПЦР.

Ингибиторы ПЦР: гемоглобин, гепарин, иммуноглобулины, билирубин и желчные кислоты, слизь, гормоны, ферменты, соли, ионы металлов, продукты жизнедеятельности микрофлоры. В последние годы все больше молекулярно-биологических методов находят практическое применение в различных областях медицины, актуальными стали вопросы автоматизации лабораторных процессов. Так, в лаборатории Синэво процесс выделения нуклеиновых кислот проходит на автоматической станции «KingFisher». Это станция выделения НК, белков и отдельных клеток из практически любых образцов: крови, лизатов, клеток, фекалий, почвы и т. д. с помощью технологии, основанной на магнитной сепарации клеток.

Преимущества над ручным процессом выделения нуклеиновых кислот:

  • автоматизированная;
  • наличие стандартных протоколов, возможность добавления протоколов пользователем;
  • производительность — 96 образцов, объем образца, мкл — от 20 до 100;
  • возможность работы с 24 и 96 луночными планшетами с лунками разной формы и глубины;
  • функция нагрева до 100 °С;
  • длительность протокола — 45 мин.

По методу детекции продуктов амплификации разделяют несколько форматов реакции:

  • классический (учет результатов реакции с помощью электрофореза);
  • с детекцией с помощью гибридизационно-иммуноферментного анализа (ГИФА);
  • с флюоресцентной детекцией по «конечной точке» (после окончания реакции);
  • с флюоресцентной детекцией в режиме «реального времени» (Real-Time PCR).

Лаборатория Синэво в диагностике инфекционных заболеваний и генетической предрасположенности работает с двумя методами детекции. ПЦР с флюоресцентной детекцией по «конечной точке» дает возможность регистрировать результат амплификации с помощью детекторов типа «Джин» или «АЛА1/4» после окончания реакции в амплификаторе «Терцик» не открывая пробирок. Этот метод качественный. Для ПЦР с флюоресцентной детекцией в режиме «реального времени» (Real-Time PCR) также используются флюоресцентно меченные олигонуклеотидные зонды. Этот метод позволяет проводить мониторинг и количественный анализ накопления продуктов реакции, так как кинетика накопления связана с исходным количеством матрицы нуклеиновой кислоты. Использование математических методов анализа результатов исследования дает возможность автоматизировать их интерпретацию, тем самым снять проблему субъективной оценки результатов электрофореграмм. Другими словами ПЦР в режиме «реального времени» — это реакция, детекция и учет результатов в одном приборе.

Результаты исследования ПЦР определяются в качественном формате — к примеру, «обнаружено» или «не обнаружено». В данной ситуации говорить о концентрации или количественном содержании исследуемого патогена не корректно. Качественный формат результата исследования удовлетворит пациента и врача в случае профилактических и скрининговых обследований. Достаточно только знать, да или нет. Применимо качественное определение для безусловных патогенов, к примеру, Chlamydia trachomatis и Trichomonas vaginalis, главное — в «правильном» адекватном биологическом материале. На смену качественному определению пришло количественное определение, и это в клинической практике имеет большое значение. Позволяет контролировать вирусную (бактериальную) нагрузку в динамике, что не маловажно при лечении.

Количественное определение патогена в биологическом материале выражается:

  • в копиях или ГЭ (геномных эквивалентах)* в 1 мл образца — для биологического материала (моча, ликвор, слюна);
  • в логарифмах Lg / на 105 клеток — для урогенитальных соскобов и цельной крови;
  • МЕ (международные единицы) / мл — современные протоколы ведения пациентов интерпретируют результаты в данных единицах.

Результаты ПЦР-анализа в режиме «реального времени» рассчитываются автоматически с помощью программного обеспечения тест-системы. Задачи оператора (врача-лаборанта) — дифференцировать биологический материал, оценить эффективность ПЦР-анализа и, ссылаясь на инструкцию к данной тест-системе, провалидировать результат. Автоматический обсчет результатов позволяет выдать пациенту результат с точностью до копии. Каждая тест-система количественного формата имеет такое понятие как «линейный диапазон». Линейный диапазон — это интервал, в пределах которого рассчитываются максимально точные результаты количественного исследования.

Добавление в Корзину

Добавить анализ Антимикросомальные антитела (АСМ тиреоидная) ценой 90 грн. для сдачи в городе Каменец-Подольский?