Методы исследований
Проточная цитофлуориметрия
В основе проточной цитофлуориметрии лежит проведение фотометрических и флуоресцентных измерений отдельных клеток, пересекающих одна за другой вместе с потоком жидкости лазерный луч монохроматического света. Фотометрические каналы используются для оценки размеров клеток и внутриклеточных структур. Частицы, отличающиеся по размерам,
Иммуноцитофлюориметрический анализ клеток производится по пяти основным параметрам:
— две характеристики светорассеяния клеток:
- FSC (forward side scatter) — показатель прямого светорассеяния;
- ортогональный SSC (90°) (side scatter) — показатель бокового светорассеяния;
— три канала детекции специфического флюоресцентного сигнала красителя на разной длине волны.
Для исследования используют несколько флюоресцентных меток, которые позволяют проводить одновременный двух-, трехцветный и более анализ, так как каждый флюорохром при прохождении через луч лазера испускает свет различной длины волны. Наиболее часто в качестве красящей метки применяется
Количество лейкоцитов и лейкоцитарная формула определяются после лизиса эритроцитов с помощью проточной цитофлуориметрии, которая позволяет анализировать физические и химические свойства клеток. Проба крови всасывается, разбавляется и окрашивается. Клетки крови затем выстраиваются в линию по одному, проходя через центр проточной камеры, в то время как лазерный луч, излучаемый полупроводником, попадает на них и в результате рассеивается в различных направлениях. Свет, рассеянный фронтально, улавливается фотодиодом и позволяет определить объем клетки. Свет, рассеянный латерально, дает информацию о компонентах клетки (ядре и гранулированных элементах), а латеральный флюоресцирующий свет информирует о величине клеточной ДНК и РНК. Свет, рассеянный латерально и флюоресцирующий латерально, принимается трубкой фотомультипликатора. В конечном результате анализатор отображает два двумерных изображения:
- на «4DIFF» (
X-ось отражает интенсивность латерального света, аY-ось — интенсивность флюоресцирующего латерального света) появляются 5 лейкоцитарных форм и группа теней эритроцитов; - на «WBC/BASO» (
X-ось отражает интенсивность латерального света, аY-ось — интенсивность фронтального света) появляются формы базофилов и остальные формы лейкоцитов, и также эритроцитарные тени.
Показатели анализируемых проб:
- эритроцитарные: количество эритроцитов, гемоглобин, гематокрит, эритроцитарные индексы (средний объем эритроцитов, среднее содержание гемоглобина в эритроците, средняя концентрация гемоглобина, ширина распределения эритроцитов);
- лейкоцитарные: общее количество лейкоцитов, лейкоцитарная формула в относительных (%) и абсолютных величинах;
- тромбоцитарные: количество тромбоцитов, тромбоцитокрит, средний объем тромбоцитов, ширина распределения тромбоцитов.
Анализатор непосредственно подсчитывает количество лейкоцитов и лейкоцитарную формулу, количество эритроцитов, гемоглобина, гематокрит и количество тромбоцитов. Кроме гемограммы и двух изображений, прибор отображает две гистограммы для эритроцитов и тромбоцитов, которые показывают количество клеток и их распределение, в зависимости от объема. Гематологический анализатор также может выявить аномальные или незрелые клетки, отображая это в виде различных предупреждений при анормальной локализации формирований клеток на «WBC/BASO» или «4DIFF».
Автоматический анализатор, работающий на основе проточной цитофлуориметрии с применением флюоресцентного или лазерного полупроводников, используется для подсчета ретикулоцитов и может проводить исследование следующих параметров: процент ретикулоцитов, абсолютное число ретикулоцитов, процент незрелых ретикулоцитов.
Определение СОЭ
- Ручной метод Вестергрена (Westergren): пробирка помещается в вертикальном положении в держатель с градацией в один миллиметр и определяется уровень седиментации красных кровяных клеток в мм/час.
- Автоматизированный метод: осуществляется на автоматических анализаторах (
СОЭ-мер ), контролируемых микропроцессором, измеряющим скорость оседания красных кровяных клеток (СОЭ) с помощью системы инфракрасных лучей. Одновременно могут быть исследованы 40–160 проб в час (в зависимости от количества используемых модулей). Седиментация происходит при комнатной температуре под воздействием гравитации, и результаты выражаются в мм/час согласно методики Westergren.
Определение показателей гемостаза
Осуществляется на полуавтоматических или автоматических анализаторах, принципом работы которых является коагулометрия для гемостаза и протеина S, а также колориметрия для антитромбина III. Для внутреннего контроля качества используются две контрольные плазмы: плазма с нормальными показателями и одна — с патологическими значениями, обеспечивая ежедневный мониторинг точности и достоверности расчетов. Из колориметрических методов исследований используется метод, состоящий в измерении абсорбции монохромного света (с длиной волны 405 нм или 540 нм), который проходит сквозь кювету, где происходит реакция формирования хромофорного вещества. Показатель абсорбции прямо пропорционален уровню антитромбина III в. исследуемой плазме.
Турбидиметрия и нефелометрия
В основе данных методов лежит формирование комплекса
Поэтому нефелометрические измерения выявляют рост выше уровня нуля (в особенности турбидиметрия, выявляющая снижение передачи до 100%), нефелометрия наиболее чувствительна к малым концентрациям исследуемых веществ. Поэтапная нефелометрия представляет собой кинетическое измерение формирования агрегатов. Время, за которое изгиб кривой «диспергированный свет — время» является максимальным и пропорционален концентрации антигена. Использование турбидиметрии и нефелометрии: определение альбуминемии и микроальбуминурии, иммуноглобулинов IgА, IgG, IgM и фракций комплемента C3, C4.
Ион-селективные электроды (ИСЭ)
Определения ИСЭ не подвержены воздействию интерференции так, как цвет пробы. Источники погрешностей — это взаимодействие с другими ионами, по свойствам схожими с исследуемым ионом, разница в степени диффузии ионов — в зависимости от их размеров.
Реакции латекс-агглютинации
Реакции
Автоматизированные методы иммунного анализа
Широкий спектр гормональных, опухолевых, инфекционных, сердечных, костных, аллергологических и аутоиммунных маркеров определяется в лаборатории «СИНЭВО» автоматизированными методами, в основе которых лежит реакция
Иммунохимические тесты используются для определения и антигенов, и антител. Чувствительность иммунологических методов повысилась за счет развития новых систем приема сигналов и технологий с твердой фазой, что позволило проводить определение уровня менее 0,1 пг/мл антигена, присутствующего в крови. Они могут применяться как для малых молекул (гаптены), так и для макромолекулярных белковых комплексов, а также для определения антител к аллергенам, инфекционным возбудителям, антигенов.
Основная характеристика иммунохимических тестов состоит в маркировке антигена или антитела веществом, генерирующим сигнал, который можно измерить, осуществляя детекцию комплекса
- радиоиммунологические тесты: используется маркировка радиоизотопами (125I, 131I, 3H,
14 °C , 32P); - иммуноферментные тесты: используется маркировка ферментами;
- иммунохимический тест с детекцией с помощью флюоресценции: используется маркировка при помощи флуоресцентных молекул (флюорохромов);
- иммунохимические тесты с детекцией за счет хемилюминесценции: используется для маркировки молекул, которые генерируют хемилюминесценцию, такие как производные люминола, акридиновые эфиры, производные нитрофенил оксалата;
- иммунохимические тесты с детекцией за счет электрохемилюминесценции (ЭХЛМ, ECLIA): используется для маркировки определенных органических соединений (соединения рутения, осмия
и т. д. ), генерирующих электрохимическое свечение.
Иммуноферментные методы
Этот метод использует маркировку ферментами, которые представляют альтернативу радиоизотопному методу. Иммуноферментный анализ базируется на двух принципах. Первый принцип заключается в установлении способности энзимов и антител, ковалентно или нековалентно связанных с твердой основой, сохранять свою функциональную активность (расщепление ферментов и связывание антигенов и антител). Второй принцип заключается в создании комплекса
Существуют модификации ИФА: гомогенные и гетерогенные методы. Гомогенные — все три стадии ИФА проходят в растворе, и между ними нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов. Гетерогенные — проходят в двухфазной системе с участием твердой фазы — носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывки), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы — в растворе). Для обнаружения антигенов используют следующие методы ИФА: конкурентный метод, «сэндвич»-метод, двойной «сэндвич»-метод. Для обнаружения специфических антител используют следующие методы ИФА: конкурентный метод, метод с использованием меченого антигена, двойной «сэндвич»-метод для антител, непрямой метод; гомогенный метод.
Конкурентный метод. В данном методе используется реакция между антигенами, связанными с твердой фазой и конкурирующими между собой меченными ферментом антителами (конъюгатом) и антителами опытной пробы. Конъюгата связывается тем меньше, чем больше специфических антител в пробе. После удаления несвязавшихся компонентов в ходе промывки измеряют ферментативную активность иммобилизованного комплекса.
Метод с использованием меченого антигена. На твердой фазе иммобилизованы антитела, специфические к определенному классу Ig (либо — к нескольким классам). Исследуемую сыворотку вносят на твердую фазу. Образуется комплекс
Метод двойного «сэндвича» для антител. На твердой фазе иммобилизованы антитела, специфические к определенному классу Ig. В результате добавления антигена происходит его связывание со специфическими антителами сыворотки. Затем к твердой фазе добавляют избыток антител к тому же антигену, меченых ферментом (конъюгат). Антитела в составе такого конъюгата должны быть поликлональными.
Непрямой метод. На твердой фазе иммобилизируют антиген, затем добавляют исследуемую сыворотку. В присутствии сывороточных специфических антител образуется комплекс (
Гомогенный метод определения антител. На твердой фазе иммобилизован антиген. В лунку вносят конъюгат этого же антигена с ферментом и исследуемую сыворотку. Специфические антитела образуют сложный комплекс: одновременно связываются с антигенами, находящимися на твердой и в жидкой фазах. При связывании антителами конъюгата изменяется активность фермента в исследуемом образце.
Наиболее часто используемыми тестами являются:
- ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ);
- EIA (иммуноферментный анализ);
- EMIT (радиоиммунологический анализ с ферментативным усилением).
ELISA является чувствительным методом, поскольку каждая молекула фермента может преобразовывать многие молекулы субстрата, выступающие в качестве усилителя реакции. Энзимы вырабатывают продукты окрашивания, которые осаждаются, так как они не диффундируют из места образования. Антиген связан с твердой поверхностью, первичное антитело связывается с антигеном, а вторичное
Метод ELISA тип «сэндвич» с присоединенным антигеном увеличивает специфичность методики, требуя связывания антитела с двумя различными эпитопами (могут происходить перекрестные реакции в одном из эпитопов, но существует возможность произойти в двух эпитопах одновременно). Моноклональное антитело связывается на твердой поверхности и связывает антиген, если оно присутствует в сыворотке пациента. Несвязанный материал промывается, одно их двух маркированных антител, которое распознает чужой эпитоп, связывается с антигеном, новое промывание разделяет несвязанные антитела, затем присоединяет к субстрату, который превращает в окрашенный продукт пропорционально количеству антигена, присутствующего в исследуемой сыворотке.
Метод ELISA конкурентного типа состоит в следующих этапах: внутренняя поверхность микропластинки покрыта антителами с точно оттитрованной концентрацией. Антиген из пробы и
Тесты EIA нуждаются во вторичном процессе для получения сигнала в результате каталитического действия фермента. В качестве твердой фазы для отделения свободного конъюгата от связанного могут использоваться пластинки с ковшиками, пластиковые шарики, пластиковые трубки, магнитные частицы или латекс с фильтрами. Использование магнитных частиц или латекса обеспечивает сокращение времени реакции. Наиболее часто используемыми ферментами являются пероксидаза из хрена, щелочная фосфатаза, бетагалактозидаза, глюкозооксидаза, уреаза и каталаза. Выбор используемого фермента определяется субстратом для распознавания. EIA колориметрический: используются хромогенные субстраты, такие как 3-этил-
Метод хемилюминесценции. Одним из современных методов лабораторной диагностики иммунологического профиля является хемилюминесцентный иммуноанализ (CLIA). Процесс хемилюминесценции включает в себя две стадии: образование продукта в электронном возбужденном состоянии (хемилюминесцентная реакция) и испускание кванта света (люминесценция). Хемилюминесценция — это процесс излучения фотонов (свечение) при переходе
EIA с хемилюминесценцией (CLIA) используют хемилюминесцентные субстраты, которые взаимодействуют с различными ферментами, используемыми для маркировки, ферментная хемилюминесцентная реакция генерирует свет. Настоящие системы используют производные люминола с пероксидазой и перекисью водорода (или другая ферментативная система, которая генерирует перекись водорода как, например, глюкозоксидаза или уриказа) плюс потенциатор (производные фенола как, например,
Преимущества иммуноферментных тестов заключаются в разработке чувствительных исследований с помощью эффекта амплификации ферментов. Реактивы являются стабильными, отсутствует радиологический риск, как и недостатки. Измерение ферментной активности может быть более сложным, чем измерение активности некоторых радиоизотопов, но ферментативная активность может быть обусловлена составляющими ингредиентами сыворотки.
Иммунохимические тесты с определением при помощи электрохемилюминесценции основываются на использовании комплекса рутения (II)-три (бипиридил) [Ru(bpy)3]2+ с трипропиламином (TPA), который генерирует электрохимический свет, в связи с циклом
- принцип «сэндвича»: сначала проба пациента перемешивается с антителами, связанными с биотином и антителами, связанными с рутением, после инкубирования смеси добавляются парамагнетические микрочастицы, обернутые стрептавидином (твердая фаза). После второго инкубирования реакционная смесь аспирируется в измерительную камеру, а свободный конъюгат удаляется. В дальнейшем используется электрический ток для возбуждения рутения и генерации сигнала, позволяющего выявить комплекс
антиген-антитело , количество вырабатываемого света прямо пропорционально количеству антигена в пробе; - конкурентный принцип: изначально перемешивается исследуемое вещество и антиген, связанный с биотином. После первичной инкубации добавляются антитела, связанные с соединением рутения, и парамагнитные микрочастицы, обернутые с стрептавидином. Конъюгированные антитела связываются с еще не занятыми участками антигенов, связанных с биотином, а весь комплекс связывается с микрочастицами за счет взаимодействия биотина со стрептавидином. После второй инкубации реактивная смесь проходит в измерительную камеру, иммунные комплексы иммобилизированы магнитным методом на поверхности электрода, а несвязанные компоненты удаляются путем вымывания. Хемилюминесцентная реакция стимулируется электрически, а количество вырабатываемого света обратно пропорционально количеству антигена;
- принцип «bridging»: схож с принципом «сэндвича», но направлен на определение антител и включает антиген, связанный с биотином, и антиген, помеченный рутением.
Метод проточной иммунофлуоресценции основан на мультиплексном анализе и возможности одновременного исследования до 25 аналитов из одного набора реагентов. В основе лежит использование магнитных микросфер размером 8 мкм. Микросферы покрыты лигандом (например, антиген, антитело, аналит
Mетод IFT (иммунофлуоресцирующих антител). В основе метода лежит иммуноферментный метод, проводимый на Биочипах с помощью флюоресцирующей метки. В качестве Биочипа используют культуру клеток
Метод иммунохроматографии. Иммунохроматографический анализ (ИХА) — метод, основанный на разделении частиц методом парной связки и реакции между антигеном и соответствующим ему антителом в биологических материалах (моча, слюна, цельная кровь, сыворотка или плазма крови
Реакции агглютинации
В реакциях агглютинации клетки или частицы связаны друг с другом за счет взаимодействия
Пассивная гемагглютинация: используются эритроциты, в которых антиген был присоединен химическим способом; агглютинация выявляет антитела к соответствующим антигенам. Например, группа АВ0 или ТРНА (тест гемагглютинации на Treponema pallidum). Обратная пассивная гемагглютинация: используются эритроциты, к которым были присоединены антитела; они агглютинируются антигенами. Агглютинация частиц желатина и других синтетических частиц: используются специальные неантигенные частицы, которые устраняют проблемы, связанные с наличием гетерофильных антител в ходе использования эритроцитов как частиц; могут заменить любой тест, основанный на гемагглютинации, за исключением тестов, использующих эритроциты из исследуемой пробы как частицы. Обеспечивают более чувствительную детекцию, чем при использовании клеток крови. Концентрация антител может определяться путем титрования: осуществляется серийное разведение сыворотки; в каждом разведении концентрация антител уменьшается в два раза. В определенном разведении не существует достаточной концентрации антител, которые связывались бы со всем антигеном полностью; титр антител представляет фактор разведения в последней пробирке, где произошла полная реакция. Реакция может быть ингибирована при повышенной концентрации антител. Ингибиторы обычно представлены в малых концентрациях. По мере растворения ингибитора, реакция становится положительной. Результат изначально отрицательный, называется «прозона».
Реакции преципитации
В реакциях преципитации комплекс
Иммуноэлектрофорез
Первоначально осуществляется электрофоретическое разделение сывороточных белков в
Бактериологические исследования
Нормальная микрофлора человека — это совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенными взаимосвязями и местом обитания. Виды нормальной микрофлоры:
- резидентная — постоянная, характерная микрофлора для определенного биотопа/локуса организма человека;
- транзиторная — временно попавшая, нехарактерная для данного биотопа; она активно не размножается при нормальном состоянии микробиоценоза.
Нормальная микрофлора выстилает слизистые оболочки в виде биопленки: этот полисахаридный каркас состоит из полисахаридов микробных клеток и муцина. Стерильными в организме человека являются: кровь, ликвор, суставная жидкость, плевральная жидкость, лимфа грудного протока, внутренние органы (сердце, мозг, паренхима печени, почек, селезенки, матка, мочевой пузырь).
Дисбактериоз/дисбиоз — это любые количественные или качественные изменения типичной для данного биотопа нормальной микрофлоры человека, возникающие в результате воздействия на макро- или микроорганизм различных неблагоприятных факторов.
Микробиологическими показателями дисбактериоза служат:
- снижение численности одного или нескольких постоянных видов бактерий;
- потеря бактериями тех или иных признаков или приобретение новых;
- повышение численности транзиторных видов бактерий;
- появление новых, несвойственных данному биотопу видов бактерий;
- ослабление антагонистической активности нормальной микрофлоры.
Среди бактерий по способности вызывать заболевание выделяют:
- Патогенные — виды бактерий, потенциально способные вызывать инфекционное заболевание. Патогенность — это способность микроорганизмов, попадая в организм, вызывать в его тканях и органах патологические изменения. Это качественный видовой признак, детерминированный генами патогенности — вирулонами. Они могут локализоваться в хромосомах, плазмидах, транспозонах.
Условно-патогенные бактерии. Основная часть УПМ относится к нормальным обитателям многих биотопов организма человека и находятся с ним в симбиотических отношениях, но при определенных условиях (снижении защитных сил организма) они могут вступать с хозяином в конкурентные отношения и вызывать у него болезни. УПМ обладают почти тем же набором факторов патогенности, что и большинство патогенных микробов — продуцируют гиалуронидазу, эластазу, коагулазу, фибринолизин, нейраминидазу, лецитиназу, нуклеазы, дезаминазы, декарбоксилазы и другие ферменты агрессии, оказывающие деполимеризующее или конформационное действие на свободные или входящие в состав клеток и волокон молекулы. Повреждающее действие ферментов агрессии обусловлено не только разрушением структур клеток, тканей и органов, но и токсическим действием продуктов ферментативного распада (мочевина, сероводород, амины и др.).- Сапрофитные бактерии не вызывают заболевания, так как они не способны размножаться в тканях макроорганизма.
Реализация патогенности идет через вирулентность — способность микроорганизма проникать в макроорганизм, размножаться в нем и подавлять его защитные свойства. Это штаммовый признак, он поддается количественной характеристике.
Бактериологические методы исследования — это совокупность методов изучения свойств микроорганизмов, определения их систематического положения. Для этого необходимо, прежде всего, изолировать отдельные виды микробов и вырастить их в виде так называемых «чистых культур», а затем идентифицировать,
Быстрое выявление микроорганизмов и изучение морфологии, необходимой для микробиологической диагностики, осуществляется путем микроскопического исследования. Микроскопическое исследование может быть свежим, между предметным и покровным стеклами, или зафиксированным и окрашенным. Под мазком понимается микробный материал (патологический материал или микробная культура), размещенный в тонком слое на поверхности предметного микроскопического стекла. Для создания мазка используются микроскопические чистые и обезжиренные стекла, которые маркируются именем пациента с одного края и названием микробиологического материала, который необходимо выявить, с другого. Для каждого патологического материала делается 2 мазка (исключением являются пункционные жидкости, из которых делают 4 мазка). Один окрашивается по Граму (для выявления бактерий), а второй — Giemsa (для определения клеточной специфичности). Мазок из патологического материала носит название окрашенного микроскопического исследования и имеет очень важное значение для медицинской бактериологии. Он применяется для следующих целей:
- быстрая ориентировка в диагнозе при неотложных состояниях (пример: бактериальный менингит);
- ориентация микробиолога при уничтожении несоответствующего патологического материала (пример: слюна вместо мокроты);
- корреляция между состоянием пациентов и результатами, которая позволяет перейти от предварительного к окончательному диагнозу.
Почти все бактерии с клиническим значением могут быть выявлены при помощи окрашенной микроскопии. Исключение составляют бактерии, которые обитают, в большинстве случаев, внутриклеточно, например, Chlamidia, а также те, которые располагаются в клеточной стенке (например, Mycoplasma и Ureaplasma) и те, которые имеют достаточные размеры для визуализации в микроскопе (пример: спирохета).
Для видовой идентификации бактерий необходимо исследовать следующие их свойства:
- Морфологические (форму и структуру бактериальной клетки).
- Тинкториальные (способность окрашиваться различными красителями).
- Культуральные (характер роста на питательной среде).
- Биохимические (способность утилизировать различные субстраты).
- Антигенные (так род сальмонелл за антигенными свойствами составляет более 2500 сероваров).
Методы окрашивания
- Простые окрашивания: используется один краситель и выявляется только морфология микроба — размеры, форма, группировка клеток, наличие капсулы. Из методов простого окрашивания традиционным и быстрым является окрашивание метиленовым синим, который окрашивает в синий цвет все клеточные элементы — бактерии, лейкоциты, клетки эпителия.
- Дифференцированное окрашивание: выявляет, кроме морфологических характеристик, и цветовые реакции микроорганизмов. Окрашивания по Граму и
Цилю-Нильсену являются наиболее используемыми в бактериологии. Различные типы окраски бактерий при использовании методики окрашивания по Граму зависят от структурных особенностей клеточной стенки. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в красный. Лейкоциты и эпителиальные клетки содержат цитоплазму, окрашенную в розовый цвет, и ядро — в красный цвет. Окрашивание поЦилю-Нильсену используется для идентификации следующих групп бактерий: Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella и ооцист Cryptosporidium, Isospora, Sarcocystis и Cyclospora. Обычно в бактериологии окрашивание поЦилю-Нильсену применяется для выделения микобактерий. Они, в отличие от других бактерий, благодаря наличию в бактериальной стенке некоторых восковых веществ, окрашиваются при комнатной температуре основным фуксином и выдерживаются для обесцвечивания в растворимых неорганических кислотах и спирте. Кислото- и спиртоустойчивые бациллы окрашиваются в красный цвет, а некислотоустойчивые — в синий цвет, так же, как и лейкоциты и клетки тканей, цитоплазма которых окрашивается в голубой с голубым ядром.
Внутренний контроль качества мазков является обязательным и проводится с положительным и отрицательным контрольным образцом. При окрашивании по Граму используем следующие контрольные образцы:
- положительный образец: Staphylococcus aureus АТСС 25923;
- отрицательный образец: Escherichia coli АТСС 25923.
Культивирование
Бактерии, принадлежащие к различным видам, могут иметь схожие микроскопические характеристики, поэтому их идентификация предполагает и изучение физиологических характеристик, исследуемых «in vitro» на питательных средах. Бактериальная культура представляет собой результат роста и размножения бактерий в питательной среде и имеет цель:
- выделение патогенных микроорганизмов из отобранного патологического материала;
- идентификация патогенных агентов;
- определение чувствительности к антибиотикам в целях инициации и мониторинга антимикробной терапии.
Классификация сред для культивирования может проводиться в зависимости от:
Толерантности:
- обычные среды, позволяющие культивировать большое количество видов бактерий;
- специальные среды, позволяющие культивировать ограниченное число видов, иногда — только предназначенные для единственного вида.
Цели исследования:
- обогащенные среды (всегда жидкие) для исследования определенных групп бактерий;
- среды для выделения: обычные, недифференциальные, дифференциальные, которые отличаются одной характерной чертой таксономической группы или рода;
- селективные среды, ингибирующие определенные группы бактерий, способствуя процессу размножения других групп.
Идентификация:
тест-среды — конвенциональные илимикротест-среды ;мультитест-среды — ассоциированные или комбинированные.
Для каждой категории отобранного патологического материала используется традиционная среда или набор сред, позволяющих выделить бактерии, наиболее часто вовлеченные в соответствующие инфекционные процессы. Этот набор традиционных сред может быть дополнен другими средами, в соответствии с
- аэробные бактерии культивируются в обычных условиях воздушной среды;
- карбоксифильные бактерии требуют инкубации при повышенном содержании СО2 в воздушной среде в эксикаторе с использованием свечки;
- строго анаэробные бактерии культивируются при помощи систем GasPak.
Большинство бактерий растут при 37 °С, в отличие от грибов, оптимальная температура роста которых — 30 °С. Длительность инкубирования сред составляет 24–48 часов для обычных бактерий; 2–5 суток — для грибов.
Наблюдение культивирования: аспект культивирования зависит от типа и состава среды. В жидкой среде рост может быть равномерным, с образованием отложений, гранул, пленки, колец, газа, пигмента. На твердых средах бактерии образуют колонии, характер которых (форма, размер, поверхность, прозрачность, консистенция, запах) и количество ориентирует микробиолога на правильный ход диагностики. Важным аспектом является отсутствие бактериального роста в случае обычных мультиконтаминированных продуктов (например, назофарингеальный экссудат, копрокультура, вагинальные выделения). Данный факт предполагает, что пациент проходит системное или местное лечение антибактериальными препаратами. Клиническое значение некоторых выделенных культур может быть установлено также на основе первичной культуры, в случае отбора выделенных культур из неконтаминированных проб (жидкость из пункции) или грамотрицательных бацилл, выделенных за определенным порогом в количественной урокультуре. При выделении монобактериальных культур из нормальных стерильно отобранных проб (гемокультура, жидкость из пункции) проводится прямая идентификация и антибиотикограмма. Из мультиконтаминированных культур проводится пересев колоний, затем — идентификация до уровня вида и тест на чувствительность к антибиотикам. Их селекция осуществляется, в зависимости от аспекта колонии, характера отобранного образца, клинической диагностики и результатов микроскопического исследования с окрашиванием. Реакции
- Str.pyogenes (группа A), вызывающие фарингиты, кожные инфекции, половые инфекции, последствия постстрептококковой инфекции;
- Streptococcus (группа B), являющиеся частью нормальной микрофлоры урогенитального тракта женщины, верхних дыхательных путей, нижнего пищеварительного тракта; у новорожденных детей, инфицированных матерью, вызывают менингит, септицемию, у взрослых — инфекции с различной локализацией, а у беременных — аборты и послеродовую септицемию;
- группы C и G вызывают схожие инфекции со стрептококком A, но немного реже.
Антибиотикограмма
Микробиологическая лаборатория играет важную роль в лечении инфекций, используя идентификацию бактерий и тестирование на чувствительность к антибиотикам. Антибиотикограмма необходима в следующих случаях:
- выбор антибиотика для лечения с учетом чувствительности к нему микроорганизмов;
- выявление тех штаммов, которые обладают энзимами, способными инактивировать действие антибиотиков in vivo;
- эпидемиологический надзор за резистентными бактериями;
- сравнение резистентных фенотипов штаммов, вызывающих нозокомиальные инфекции.
Проведение антибиотикограммы являются стандартными: состав среды, рН среды, плотность посевного материала, длительность и температура инкубации, стабильность и концентрация микробиального вещества. Лаборатория имеет автоматический «расшифровщик» антибиотикограммы (по диффузиметрическому методу), который имеет встроенную в софт программу — «Эксперт», которая соответствует этому стандарту, со способностью выявлять штаммы, продуцирующие пенициллиназу и
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗАТОР «VITEK 2 Compact». Анализатор «VITEK 2 Compact» предназначен для работы с «чистой» культурой бактерий и выполняет автоматическую идентификацию культур и определение чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам.
Этапы исследования:
1. Технология посевов биоматериалов и обработки роста бактерий аналогична классическому методу. Для ускорения роста медленнорастущих бактерий и определения их рода используются хромогенные среды (24–48 часов).
2. Из
3. Приготовление суспензии бактерий из одной или нескольких морфологически идентичных колоний для:
3.1. Идентификация культур проводится на картах, содержащих определенный набор биохимических тестов, позволяющих идентифицировать большинство:
- ферментирующих и не ферментирующих грамотрицательных палочек;
- клинически важных грамположительных микроорганизмов;
- клинически значимых прихотливых микроорганизмов (Neisseri/Haemophilus);
- клинически значимых анаэробных микроорганизмов и видов рода Corynebacterium;
- идентификация аэробных спорообразующих палочек семейства Bacillaceae;
- клинически значимых дрожжей и дрожжеподобных организмов.
3.2. Определение чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам для большинства клинически значимых грамотрицательных палочек, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae и дрожжевых грибов.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Полимеразная цепная реакция — это технология, направленная на получение in vitro копий специфической нуклеотидной последовательности генома определенного конкретного микроорганизма, вируса. В основе ПЦР лежит многократное копирование определенного фрагмента дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) с помощью фермента термоустойчивой
Преимущества метода ПЦР перед другими методами клинической лабораторной диагностики:
- Универсальность. Метод ПЦР дает возможность работать практически с любым видом биологического материала: цельная кровь, плазма, урогенитальные соскобы, слюна, моча, буккальный, заднеглоточный соскоб, спинномозговая, синовиальная жидкость.
- Высокая специфичность. Высокая специфичность метода основана на выявлении уникальных для микро- (макро-) организма участков генетического материала. Высокая специфичность ПЦР (100%) определяется способностью праймеров точно распознавать определенный участок нуклеиновой кислоты и связываться с ним по принципу комплиментарности. Таким образом,
ПЦР-диагностикумы дают возможность избежать проблем, связанных сперекрестно-реагирующими антигенами. - Высокая чувствительность. Высокая чувствительность, основана на экспоненциальном принципе накопления продукта. Аналитическая чувствительность дает возможность проведения не только качественной (наличие), но и количественной (концентрация) оценки содержания нуклеиновой кислоты. В настоящее время реальный порог чувствительности амплификационных
тест-систем позволяет определять несколько сот копий в исследуемом образце. - Относится к методам прямого выявления возбудителя.
Этапы
- обработка клинического материала;
- амплификация;
- детекция продуктов амплификации.
Обработка клинического материала;
- пробоподготовка биологического материала;
- выделение ДНК/РНК с добавлением ВКО (внутренний контрольный образец).
Внутренний контроль
Выделение ДНК/РНК является ответственным этапом подготовки материала для проведения амплификации,
Ингибиторы ПЦР: гемоглобин, гепарин, иммуноглобулины, билирубин и желчные кислоты, слизь, гормоны, ферменты, соли, ионы металлов, продукты жизнедеятельности микрофлоры. В последние годы все больше
Преимущества над ручным процессом выделения нуклеиновых кислот:
- автоматизированная;
- наличие стандартных протоколов, возможность добавления протоколов пользователем;
- производительность — 96 образцов, объем образца, мкл — от 20 до 100;
- возможность работы с 24 и 96 луночными планшетами с лунками разной формы и глубины;
- функция нагрева до 100 °С;
- длительность протокола — 45 мин.
По методу детекции продуктов амплификации разделяют несколько форматов реакции:
- классический (учет результатов реакции с помощью электрофореза);
- с детекцией с помощью
гибридизационно-иммуноферментного анализа (ГИФА); - с флюоресцентной детекцией по «конечной точке» (после окончания реакции);
- с флюоресцентной детекцией в режиме «реального времени» (
Real-Time PCR).
Лаборатория Синэво в диагностике инфекционных заболеваний и генетической предрасположенности работает с двумя методами детекции. ПЦР с флюоресцентной детекцией по «конечной точке» дает возможность регистрировать результат амплификации с помощью детекторов типа «Джин» или «АЛА1/4» после окончания реакции в амплификаторе «Терцик» не открывая пробирок. Этот метод качественный. Для ПЦР с флюоресцентной детекцией в режиме «реального времени» (
Результаты исследования ПЦР определяются в качественном формате — к примеру, «обнаружено» или «не обнаружено». В данной ситуации говорить о концентрации или количественном содержании исследуемого патогена не корректно. Качественный формат результата исследования удовлетворит пациента и врача в случае профилактических и скрининговых обследований. Достаточно только знать, да или нет. Применимо качественное определение для безусловных патогенов, к примеру, Chlamydia trachomatis и Trichomonas vaginalis, главное — в «правильном» адекватном биологическом материале. На смену качественному определению пришло количественное определение, и это в клинической практике имеет большое значение. Позволяет контролировать вирусную (бактериальную) нагрузку в динамике, что не маловажно при лечении.
Количественное определение патогена в биологическом материале выражается:
- в копиях или ГЭ (геномных эквивалентах)* в 1 мл образца — для биологического материала (моча, ликвор, слюна);
- в логарифмах Lg / на 105 клеток — для урогенитальных соскобов и цельной крови;
- МЕ (международные единицы) / мл — современные протоколы ведения пациентов интерпретируют результаты в данных единицах.
Результаты